FISH檢測要求使用中性福爾馬林（不恰當的pH值會損傷DNA）固定24-48小時。

固定時間不足會導致組織較軟，在預處理過程中會丟失部分組織和信號。

固定時間過長導致組織變脆，不利于切片，也會導致大分子交聯情況嚴重，很難進行消化。

福爾馬林固定石蠟包埋的組織需要用蛋白酶進行消化以去除多余的組織來暴露細胞。

如果消化不足（酶濃度低、溫度不適合、時間太短），鏡下會出現云霧狀組織覆蓋在細胞上，無法觀測到暴露獨立的細胞核，從而降低雜交效率并很難選擇細胞進行計數，這種情況需要重新制片。

 

如果消化過度，則細胞核被損傷，失去正常的圓形完整形狀，變得支離破碎，甚至像鬼影一樣，這種情況只能重新制片。

FISH實驗中可能因為各種原因導致高背景

可能原因包括：

1、不適合的探針量

2、不適合的雜交后洗

3、樣本中有過多的重復序列

解決方法包括：

1、使用合適的探針量

2、改善雜交后洗環節：

a、準備新鮮配制的洗滌液；b、檢查洗滌液的pH、c、檢查水浴缸的溫度（71-73度，一次不超過6片洗滌，每次洗滌后重新升溫）；d、洗滌時震蕩洗滌缸；e、延長洗滌時間（zui長5分鐘）。

3、使用DNA阻斷劑，如Cot-1 DNA等。

zui常見的DNA競爭性阻斷劑是COT-1 DNA，它適用于阻斷人基因組中的Alu和L1家族序列，其效能是鮭精DNA的十倍。當FISH檢測出現高背景，且排除預處理和雜交后洗過程中可能出現的問題時，實驗者可適當加入1μg COT-1 DNA/10 μl 探針，以阻斷可能引起非特異性結合的重復性序列，從而減少背景的產生。