檸檬酸（CA）檢測試劑盒微量法說明書，注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

CA 是生物體內常見的有機酸，是重要的食品風味物質。此外，CA 是三羧酸循環第一步反應的產物。

測定原理：

酸性條件下，檸檬酸還原 Cr6+生成 Cr3+，在 545nm 處有特征吸收峰；通過測定 545nm 吸光值的增加即可計算出樣品中檸檬酸含量。

自備實驗用品及儀器：

低溫離心機、水浴鍋、可調式移液槍、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板和蒸餾水。

檸檬酸（CA）檢測試劑盒試劑組成和配置：

試劑一：液體×2 瓶，4℃保存。試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體×1 管，－20℃保存。

試劑四：粉劑×1 管，室溫保存。臨用前配制，加入 2mL 試劑一，充分溶解。試劑五：液體×1 管，4℃避光保存。

標準品：液體×1 管，250μ mol/L 檸檬酸標準液，4℃保存。

樣品中檸檬酸提取：

1. 液體樣品中檸檬酸提取：取 0.1mL 液體加試劑一 0.9mL，充分混勻，11000g，4℃離心 10min，取上清液，待測。

2. 組織中檸檬酸提取：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿。11000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

3. 線粒體中檸檬酸提取：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿，600g/min，4℃離心 5min；取上清至另一EP 管中，11000g，4℃離心 10min，棄上清（此上清液可用于細胞質 CA 含量測定）；向沉淀中加試劑二 200μ l，以及試劑三 2μ l，充分懸浮溶解，11000g，4℃離心 10min，取上清液，待測。

4. 細菌、真菌中：按照細胞數量（104 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；11000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

 檸檬酸（CA）檢測試劑盒測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱 30 min，調節波長到 545 nm，蒸餾水調零。
2. 試劑一置于 30℃水浴中預熱 30min。
3. 空白管：取 0.5 mL EP 管，依次加入 20μ L 蒸餾水，140μ L 試劑一，20μ L 試劑四，20μ L 試劑五，混勻后室溫靜置 30min，于 545nm 測定吸光度，記為A 空白管。

4. 標準管：取 0.5 mL EP 管，依次加入 20μ L 標準液，140μ L 試劑一，20μ L 試劑四，20μ L 試劑五，混勻后室溫靜置 30min，于 545nm 測定吸光度，記為A 標準管。
5. 測定管：取 0.5 mL EP 管，依次加入 20μ L 上清液，140μ L 試劑一，20μ L 試劑四，20μ L 試劑五，充分混勻后室溫靜置 30min，于 545nm 測定吸光度，記為A 測定管。
注意：空白管和標準管只需測定一次。
計算公式：
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1. 按液體樣品的體積計算
檸檬酸含量（nmol/L）= [C 標準液×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)]×樣品稀釋倍數×V 總
= 2500×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)
C 標準液：250μ  mol/L=0.25 m mol/L；樣品稀釋倍數：（0.1 mL 樣品+0.9mL 試劑一）÷ 0.1 mL樣品=10；V 總：1mL。
2. 按組織質量計算
檸檬酸含量（nmol/g 鮮重）= [C 標準液×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)]×V
總÷W
= 250×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管) ÷W C 標準液：250 μ mol/L；V 總：上清液總體積，1.0 mL=0.001 L；W：樣品質量，g。
3. 按蛋白含量計算
檸檬酸含量（nmol/mg prot）= [C 標準液×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)]÷Cpr
= 250×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管) ÷Cpr C 標準液：250 μ mol/L=0.25μ mol/mL；Cpr：上清液蛋白質含量，mg/mL。
4. 按細胞數量計算
檸檬酸含量（nmol/104 cell）= [C 標準液×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)]×V
總÷細胞數量
= 250×(A 測定管－A 空白管) ÷(A 標準管－A 空白管) ÷細胞數
量
C 標準液：250 μ mol/L；V 總：上清液總體積，1.0 mL=0.001 L；

b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下
3. 按液體樣品的體積計算
檸檬酸含量（nmol/L）= [C 標準液×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)]×樣品稀釋倍數×V 總
= 2500×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)
C 標準液：250μ  mol/L=0.25 m mol/L；樣品稀釋倍數：（0.1 mL 樣品+0.9mL 試劑一）÷ 0.1 mL樣品=10；V 總：1mL。
4. 按組織質量計算
檸檬酸含量（nmol/g 鮮重）= [C 標準液×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)]×V
總÷W
= 250×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管) ÷W C 標準液：250 μ mol/L；V 總：上清液總體積，1.0 mL=0.001 L；W：樣品質量，g。

檸檬酸（CA）檢測試劑盒5. 按蛋白含量計算
檸檬酸含量（nmol/mg prot）= [C 標準液×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)]÷Cpr
= 250×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管) ÷Cpr C 標準液：250 μ mol/L=0.25μ mol/mL；Cpr：上清液蛋白質含量，mg/mL。
6. 按細胞數量計算
檸檬酸含量（nmol/104 cell）= [C 標準液×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)]×V
總÷細胞數量
= 250×(A 測定管－A 空白管) ÷(A 標準管－A 空白管) ÷細胞數
量
C 標準液：250 μ mol/L；V 總：上清液總體積，1.0 mL=0.001 L；
注意事項：
1. 樣品處理等過程均需要在冰上進行。
2. 試劑四需現配現用，配置好的一周內使用完；
3. 試劑五為易致癌物質，實驗過程中，需佩戴手套，避免試劑五濺到皮膚上。
4. 檸檬酸提取液不能用于蛋白含量測定，如需測定蛋白含量，需另取組織，使用本公司 BCA 試劑盒進行測定。