結合態淀粉合成酶（GBSS）檢測試劑盒微量法活性說明書

測定意義：

GBSS（EC 2.4.1.21）以束縛態存在于淀粉體中，催化淀粉鏈的加長反應，主要負責直鏈淀粉的合成。

測定原理：

GBSS 催化ADPG 與淀粉引物(葡聚糖)反應,將葡萄糖分子轉移到淀粉引物上，同時生成ADP； 進一步通過反應體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化 NADP+還原為 NADPH，其中 NADPH 生成量與前一步反應生成的 ADP 數量呈正比，通過 340nm 下測定 NADPH的增加量，可以計算 GBSS 活性。

自備實驗用品及儀器：

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 100mL×2 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 40mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 14mL 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 8mL 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 10mL 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑五：液體×1 支，-20℃保存；臨用前加入 500μ L 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 500μ L 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

結合態淀粉合成酶（GBSS）檢測試劑盒粗酶液制備:

稱取 0.1~0.2g 組織（建議稱取約 0.1g 組織），加入 1mL 提取液，冰浴中勻漿。10000g ， 4℃離心10min，棄上清，在沉淀中加入 1mL 提取液充分混勻，置冰上待測。

測定步驟:

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。

2、在 EP 管中按順序加入下列試劑

混勻，30℃保溫 20 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻

混勻，30℃保溫 30 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻，10000g 25℃離心 10min，取上清液（如果一次性測定樣本較多，可以將試劑四、五和六按比例配成混合液）

混勻后立即 340 nm 波長下記錄初始吸光度A1 和 2min 后的吸光度 A2，計算 Δ A=A2-A1。注意：試劑二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混勻。

結合態淀粉合成酶（GBSS）檢測試劑盒GBSS 活性計算:

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下： 1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。GBSS（nmol/min/mg prot）＝[Δ A×V 反總÷（ε ×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數

=528×Δ A÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。2、按照樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

GBSS 活性（nmol/min /g 鮮重）=[Δ A×V 反總÷（ε ×d）×109]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T× 稀釋倍數=528×Δ A÷W

V 反總：反應體系總體積，2.85×10-4 L；ε ：NADPH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm； d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.075 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T： 反應時間，2 min；稀釋倍數：1.73；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量。

b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下： 1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。GBSS（nmol/min /mg prot）＝[Δ A×V 反總÷（ε ×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數

=1056×Δ A÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。2、按照樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

GBSS 活性（nmol/min /g 鮮重）=[Δ A×V 反總÷（ε ×d）×109]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T× 稀釋倍數=1056×Δ A÷W

結合態淀粉合成酶（GBSS）檢測試劑盒V 反總：反應體系總體積，2.85×10-4 L；ε ：NADPH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm； d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.075 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL； T：反應時間，2 min；稀釋倍數：1.73；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量。