可溶性淀粉合成酶（SSS）檢測(cè)試劑盒微量法活性說(shuō)明書(shū)

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

SSS（EC 2.4.1.21）通常以游離態(tài)存在于質(zhì)體基質(zhì)中，催化淀粉鏈延長(zhǎng)，主要負(fù)責(zé)支鏈淀粉的合成。

測(cè)定原理：

SSS 催化 ADPG 與淀粉引物(葡聚糖)反應(yīng)，將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上，同時(shí)生成 ADP， 在反應(yīng)體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化 NADP+ 還原為NADPH，NADPH 生成量與前一步反應(yīng)中 ADP 生成量呈正比，340nm 下測(cè)定 NADPH 增加量即可計(jì)算SSS 活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

可溶性淀粉合成酶（SSS）檢測(cè)試劑盒試劑的組成和配制：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：40mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 14mL 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 8mL 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 10mL 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑五：液體×1 支，-20℃保存；臨用前加入 500μ L 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 500μ L 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

粗酶液制備:

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、在 EP 管中按順序加入下列試劑

混勻，30℃保溫 20 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻

混勻，30℃保溫 30 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻，10000g 25℃離心 10min，取上清液（如果一次性測(cè)定樣本較多，可以將試劑四、五和六按比例配成混合液）

可溶性淀粉合成酶（SSS）檢測(cè)試劑盒混勻后立即 340 nm 波長(zhǎng)下記錄初始吸光度A1 和 2min 后的吸光度 A2，計(jì)算 Δ A=A2-A1。注意：試劑二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混勻。

SSS 活性計(jì)算：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下： 1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。SSS（nmol/min /mg prot）＝[Δ A×V 反總÷（ε ×d）×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T×稀釋倍數(shù)

=528×Δ A÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。2、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SSS 活性（nmol/min /g 鮮重）=[Δ A×V 反總÷（ε ×d）×109]÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T× 稀釋倍數(shù)

=528×Δ A÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.85×10-4 L；ε ：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm； d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.075 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T： 反應(yīng)時(shí)間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.73；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下： 1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。SSS（nmol/min/mg prot）＝[Δ A×V 反總÷（ε ×d）×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T×稀釋倍數(shù)

=1056×Δ A÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。2、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SSS 活性（nmol/min/g 鮮重）=[Δ A×V 反總÷（ε ×d）×109]÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T× 稀釋倍數(shù) =1056×Δ A÷W

可溶性淀粉合成酶（SSS）檢測(cè)試劑盒V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.85×10-4 L；ε ：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm； d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.075 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T： 反應(yīng)時(shí)間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.73；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。