脂氧合酶（LOX）檢測試劑盒微量法說明書，注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。 

產品內容：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。 

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加2ml試劑二，充分溶解。 

產品說明：

LOX廣泛存在于植物組織中，催化不飽和脂肪酸氧化反應，導致膜脂過氧化。在植物的生長發育、成熟衰老及逆境脅迫過程中具有重要作用。 

LOX催化亞油酸氧化，氧化產物在234nm處有特征吸收峰；測定234nm吸光度增加速率，來計算LOX活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可調式移液槍和蒸餾水。 

脂氧合酶（LOX）檢測試劑盒操作步驟：

一、粗酶液提取：

按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。16000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測。

二、測定：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調節波長到234 nm，蒸餾水調零。 

2. 試劑二在25℃水浴中預熱30 min以上。 

3. 空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸餾水、160μL試劑二和20μL試劑三，迅速混勻后于234nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為A1和A2。 

4. 測定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、160μL試劑二和20μL試劑三，迅速混勻后于234nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為A3和A4。

三、LOX活性計算：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下 

（1） 按照蛋白濃度計算 

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化0.001個單位為1個酶活單位。 

LOX (U/mg prot) = [(A4－A3)－(A2－A1)]×V反總÷(Cpr×V樣)÷T×1000

= 10000×[(A4－A3)－(A2－A1)]÷Cpr

（2） 按照樣本質量計算

     活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化0.001個單位為1個酶活單位。

LOX (U/g) = [(A4－A3)－(A2－A1)]×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T×1000

 = 10000×[(A4－A3)－(A2－A1)]÷W

Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，需另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；V反總：反應體系總體積，200μL=2×10-4L；V樣：加入反應體系中上清液體積，20μL=0.02mL；W ：樣品質量，g；V樣總：上清液總體積，1mL；T：反應時間。 

脂氧合酶（LOX）檢測試劑盒b. 使用96孔板測定的計算公式如下 

（1） 按照蛋白濃度計算 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化0.001個單位為1個酶活單位。

LOX (U/mg prot) = [(A4－A3)－(A2－A1)]×V反總÷(Cpr×V樣)÷T×1000

= 10 000×[(A4－A3)－(A2－A1)]÷Cpr

（2） 按照樣本質量計算 活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化0.001個單位為1個酶活單位。 

LOX (U/g) = [(A4－A3)－(A2－A1)]×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T×1000

 = 10 000×[(A4－A3)－(A2－A1)]÷W

Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，需另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；V反總：反應體系總體積，200μL=2×10^-4L；V樣：加入反應體系中上清液體積，20μL=0.02mL；W ：樣品質量，g；V樣總：上清液總體積，1mL；T：反應時間。 

脂氧合酶（LOX）檢測試劑盒注意事項：

1.試劑三易自發氧化，從而導致空白管測定值偏高，必須臨用前配制，并且當天使用完畢。 

2.樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日完成酶活性測定