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IP是利用抗原蛋白質和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質的“prorein A”特異性地結合到免疫球蛋白的FC片段的現象活用開發出來的方法。目前多用精制的prorein A預先結合固化在argarose的beads上,使之與含有抗原的溶液及抗體反應后,beads上的prorein A就能吸附抗原達到精制的目的。
首先,實驗zui需要注意點就是抗體的性質。抗體不同和抗原結合能力也不同,免染能結合未必能用在IP反應。廣州賽誠生物科技有限公司建議仔細檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是問題。
其次,要注意溶解抗原的緩沖液的性質。多數的抗原是細胞構成的蛋白,特別是骨架蛋白,緩沖液必須要使其溶解。為此,必須使用含有強界面活性劑的緩沖液,盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結合。另一面,如用弱界面活性劑溶解細胞,就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶解也產生與其它的蛋白結合的結果,抗原決定族被封閉,影響與抗體的結合,即使IP成功,也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結果。
再次,為防止蛋白的分解,修飾,溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑,低溫下進行實驗。每次實驗之前,首先考慮抗體/緩沖液的比例。抗體過少就不能檢出抗原,過多則就不能沉降在beads上,殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原,過多則抗原被稀釋。
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