PCR引物通用設計原則

時間：2023/2/14閱讀：508

PCR引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。因此，引物的優劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。

PCR引物的通用設計原則：

1、引物應用核酸系列保守區內設計并具有特異性：引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補堿基同源。

2、產物不能形成二級結構：某些引物無效的主要原因是引物重復區DNA二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。

3、引物長度一般在15~30堿基之間。

4、 G+C含量在40%~60%之間。

5、堿基要隨機分布：引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區錯誤引發。

6、引物自身不能有連續4個堿基的互補：否則引物自身會折疊成發夾狀結構牙引物本身復性

7、引物之間不能有連續4個堿基的互補：兩引物之間不應不互補性，尤應避免3′端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應多于4個連續堿基的同源性或互補性。

8、引物5′端可以修飾。

9、引物3′端不可修飾。

10、引物3′端要避開密碼子的第3位：如擴增編碼區域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡并，會影響擴增特異性與效率。

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