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ELISA檢測夾心法針對抗原分子上2個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物。
夾心法常用于檢測大分子抗原，一般的操作步驟為:
1、將具有專一性的抗體固著（coating）于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗體
2、 加入待測檢體，檢體中若含有待測的抗原，則其會與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結
3、 洗去多余待測檢體，加入另一種對抗原專一的一次抗體，與待測抗原進行鍵結
4、 洗去多余未鍵結一次抗體，加入帶有酶的二次抗體，與一次抗體鍵結
5、洗去多余未鍵結二次抗體，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結果
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